Polybrene (10 mg/mL)

Catalog Number：LE110

01/產(chǎn)品概述

Polybrene（聚凝胺，hexadimethrine bromide）是一種多聚陽(yáng)離子聚合物，廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒及慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，是一種常用的促感染試劑，能夠顯著提高病毒與細(xì)胞的接觸及感染效率，其作用機(jī)理可能是通過(guò)中和細(xì)胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進(jìn)吸附作用。同時(shí)，Polybrene也常用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以增強(qiáng)脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。Polybrene也是一種有名的抗肝素劑（肝素拮抗劑），常用來(lái)生產(chǎn)非特異性凝集的紅細(xì)胞。它還參與到低分子量DNA的轉(zhuǎn)化中。此外，Polybrene也多用于蛋白測(cè)序，因?yàn)樾┝康腜olybrene在自動(dòng)測(cè)序分析可明顯改善多肽的降解現(xiàn)象。PVDF膜加入polybrene還能提高膜的親和性。

本產(chǎn)品以溶液形式提供，粉末用 0.9% NaCl 配制成10 mg/mL的溶液，并用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。使用時(shí)一般按1:1000-1:5000稀釋，依細(xì)胞種類不同稀釋比例不同，具體使用濃度請(qǐng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。-20℃ 保存，有效期24個(gè)月。建議分裝保存，避免反復(fù)凍融。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

v 即用型試劑，無(wú)需進(jìn)行試劑配置，簡(jiǎn)單方便。

v 無(wú)菌制劑，可直接加入細(xì)胞使用。

05/實(shí)驗(yàn)步驟

慢病毒感染（Lentiviral Infection）實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1. 包裝慢病毒并測(cè)定慢病毒滴度，通過(guò)病毒滴度和MOI計(jì)算目的細(xì)胞感染所需的病毒量。

2. 實(shí)驗(yàn)前一天，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的目的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1-3×10⁵/mL，加入12孔板，1 mL/孔。放入37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

? 懸浮細(xì)胞不需要提前一天接種，實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞計(jì)數(shù)接種后，直接加入病毒混合液即可。

3. 配制慢病毒+polybrene+培養(yǎng)基混合液。polybrene一般使用濃度為2-10 μg/mL，但對(duì)某些細(xì)胞（如末端分化的神經(jīng)元，DC細(xì)胞等）毒性較大，初次使用建議先做毒性測(cè)試。

4. 吸去12孔板中目的細(xì)胞的培養(yǎng)基，加入3中配制的慢病毒混合液，放入37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

? 感染懸浮細(xì)胞或半懸浮細(xì)胞，則需采用平角離心轉(zhuǎn)染法，即將適量的病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)板后，封好口，放入平角離心機(jī)中，低速（200xg）離心?1 h?，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

? 若實(shí)驗(yàn)條件有限，沒(méi)有平角離心機(jī)，可用離心管代替，將細(xì)胞吸入離心管中，進(jìn)行低速離心，去掉大部分上清，加入適量的病毒液，室溫放置?15 min，然后將細(xì)胞和病毒液同時(shí)吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

5. 病毒感染16 h后更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

6. 病毒感染36-48 h后，可加入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株篩選，或采用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、western blot、qPCR等方法檢測(cè)目的基因表達(dá)情況。

06/適用范圍

Polybrene目前廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒及慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，是一種常用的促感染試劑，能夠顯著提高病毒與細(xì)胞的接觸及感染效率。

07/注意事項(xiàng)

1. Polybrene對(duì)某些細(xì)胞（如末端分化的神經(jīng)元、DC 細(xì)胞）毒性較大，初次應(yīng)用建議先做毒性測(cè)試。

2. 本說(shuō)明書中提供的Polybrene使用濃度范圍僅供參考，具體使用濃度請(qǐng)參考相關(guān)文獻(xiàn)。

3. 為了您的健康安全，請(qǐng)規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

4. 所有慢病毒操作均需在BSL2級(jí)生物安全柜中進(jìn)行。

5. 本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。

08/實(shí)驗(yàn)案例分析

1. 提前一天使用10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001），待細(xì)胞密度為75% 左右開(kāi)始包裝慢病毒。

2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進(jìn)行慢病毒包裝。取10 μL慢病毒包裝輔助質(zhì)粒混合物（Package Plasmid Mix）加入到2 mL離心管中，加入2.5 μL表達(dá)GFP 的對(duì)照質(zhì)粒（Control Plasmid），輕輕混合，加入32 μL PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒混合，室溫孵育3分鐘。

3. 往上述混合物中加入1.8 mL無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

4. 將上述1.8 mL轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物輕輕地逐滴均勻加入10 cm皿慢病毒包裝細(xì)胞中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿混勻，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)產(chǎn)毒。

5. 轉(zhuǎn)染24 h后，棄去初始病毒上清液，加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

6. 轉(zhuǎn)染48 h后，收集病毒上清液，再加入10 mL新鮮的*培養(yǎng)基(DMEM +10% FBS)至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

7. 轉(zhuǎn)染72 h后，進(jìn)行二次病毒上清液收集，與48 h收集的上清液混合后，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，0.22 μm濾器過(guò)濾，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進(jìn)行20倍濃縮，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）重懸慢病毒顆粒。

8. 使用上述制備的慢病毒感染目的細(xì)胞HEK293T，設(shè)置兩組實(shí)驗(yàn)組: (1) 病毒+polybrene (10 μg/mL)+培養(yǎng)基混合液，(2) 病毒+培養(yǎng)基混合液(不添加polybrene)。

9. 使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，并拍照記錄。使用流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計(jì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2: 慢病毒(GFP)感染目的細(xì)胞HEK293T的過(guò)程中是否添加polybrene (10 μg/mL)的感染效率對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

09/其他相關(guān)產(chǎn)品