Puromycin(10mg/mL)

CatalogNumber：PS610

01/Puromycin嘌呤霉素PS610產(chǎn)品概述：

Puromycin是來源于Streptomycesalboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素。嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3′末端的類似物，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點(diǎn)結(jié)合后，不會(huì)參與隨后的任何反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽，從而殺死革蘭氏陽性菌、各種動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞。

Puromycin常用于篩選通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒感染、轉(zhuǎn)化等方法能表達(dá)pac基因（puror）的真核或原核多克隆或單克隆細(xì)胞。pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAC，PuromycinN-acetyl-tranferase)，賦予機(jī)體對(duì)嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達(dá)pac基因的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定細(xì)胞株。嘌呤霉素在細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選中的普遍應(yīng)用與慢病毒載體的特性有關(guān)，現(xiàn)在很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標(biāo)記為puror)，從而利用嘌呤霉素篩選特定基因的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。Puromycin的特點(diǎn)是快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的不表達(dá)pac基因的細(xì)胞。Puromycin不僅用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。在某些特定情況下，嘌呤霉素也可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。

　　本品是無菌的Puromycin嘌呤霉素（10mg/mL）鹽酸鹽溶液，經(jīng)過濾除菌，可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件：冰袋（wetice）運(yùn)輸。-20℃保存，有效期12個(gè)月。建議分裝保存，避免反復(fù)凍融。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

　　即用型試劑，無需進(jìn)行試劑配置，簡(jiǎn)單方便。

　　無菌制劑，可直接加入細(xì)胞使用。

05/Puromycin 嘌呤霉素（10 mg/mL）實(shí)驗(yàn)步驟

一、Dose-responsecurveorkillcurve嘌呤霉素劑量反應(yīng)曲線的確定(以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒感染為例）

　　嘌呤霉素的有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝及細(xì)胞所處細(xì)胞周期等因素相關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA或感染病毒的細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/感染細(xì)胞的最小濃度嘌呤霉素非常重要。對(duì)于初次使用的細(xì)胞，一般需要通過實(shí)驗(yàn)來確定適合自身實(shí)驗(yàn)體系的劑量反應(yīng)曲線(dose-responsecurveorkillcurve)。

　　1.提前一天在24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接種細(xì)胞，設(shè)置劑量梯度及復(fù)孔，37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。

　　2.次日，將培養(yǎng)過夜后的細(xì)胞更換含不同濃度嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基（新鮮配置），如0、1、2.5、5、7.5、10、15、20μg/mL等濃度梯度，設(shè)置至少5個(gè)濃度梯度，37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

　　3.由于嘌呤霉素可以快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的未表達(dá)pac基因的細(xì)胞，所以在添加嘌呤霉素后的1-2天就可以觀察細(xì)胞存活率，從而確定有效殺死正常細(xì)胞的藥物最小濃度。如果細(xì)胞耐藥性比較強(qiáng)，需要每日監(jiān)測(cè)細(xì)胞，觀察存活細(xì)胞率，約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，一般4-10天內(nèi)即可確定嘌呤霉素的最小濃度。

二、建議使用濃度

　　哺乳動(dòng)物細(xì)胞：1-10μg/mL，最佳濃度需根據(jù)嘌呤霉素劑量反應(yīng)曲線來確定。

　　大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125μg/mL。

　　?使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉(zhuǎn)株需要精確的pH值調(diào)節(jié)，并受宿主細(xì)胞本身的影響。

三、哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選

　　轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)粒或者感染含有該基因的病毒后，即可使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)株。

　　1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此為處理組。

　　?當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí)，抗生素作用明顯。細(xì)胞過于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降，所以細(xì)胞的密度最好不超過35%。轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，如果細(xì)胞過密也可以消化后重新接種細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后即可進(jìn)行嘌呤霉素篩選。

　　?建議同時(shí)做一個(gè)空白正常細(xì)胞的對(duì)照組。

　　2.每隔2-3天，更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。

　　3.篩選2-10天后，對(duì)照組正常細(xì)胞應(yīng)該100%死亡，處理組中存活的細(xì)胞為表達(dá)pac基因的細(xì)胞。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行多克隆或單克隆細(xì)胞的篩選。

　　?應(yīng)每日進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要24小時(shí)，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在2-10天。

　　4.待細(xì)胞可以穩(wěn)定生長(zhǎng)后，嘌呤霉素的濃度可以減半用于后續(xù)的培養(yǎng)。在得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后，一般建議嘌呤霉素也須持續(xù)加入，并2-3天更換含有嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)液。

06/適用范圍

　　Puromycin嘌呤霉素（10mg/mL）普遍應(yīng)用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選和維持，也可以用來篩選轉(zhuǎn)化攜帶pac基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。

07/注意事項(xiàng)

　　1.為了您的健康安全，請(qǐng)規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn)。

　　2.本產(chǎn)品對(duì)人體有害，操作時(shí)請(qǐng)小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

　　3.本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。

08/Puromycin 嘌呤霉素（10 mg/mL）實(shí)驗(yàn)案例分析

　　1.提前一天使用10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)ViralStarsLentivirusPackagingCellLine（CL110001），待細(xì)胞密度為75%左右開始包裝慢病毒。

　　2.使用ViralStarsLPLentivirusPackagingKit（LP110-10）進(jìn)行慢病毒包裝，具體步驟參考LP110-10產(chǎn)品說明書。

　　3.收集慢病毒上清液，300xg離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，0.22μm濾器過濾，使用ViralStarsLCLentivirusConcentrationSolution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進(jìn)行20倍濃縮，使用1mLViralStarsLSLentivirusStorageSolution（LS110R）重懸慢病毒顆粒。

　　4.提前一天在24孔板中鋪Hela細(xì)胞，使用上述制備的慢病毒感染目的細(xì)胞HeLa。在EP管中做病毒10倍梯度稀釋，連續(xù)6個(gè)稀釋梯度。稀釋方法如下：準(zhǔn)備6個(gè)?菌EP管，每個(gè)EP管中加?450μL新鮮的*培養(yǎng)基（含10μg/mLpolybrene），取待測(cè)定病毒液50μL加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記50μL），混勻后取50μL病毒稀釋液加?到第?個(gè)EP管中（標(biāo)記5μL），以此類推，直到稀釋到最后?管。棄去24孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，并做好標(biāo)記，??操作，不要吹起細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。

　　5.慢病毒感染16h后，吸去帶病毒的培養(yǎng)基，在每個(gè)孔中再加入?500μL?預(yù)熱的新鮮*培養(yǎng)基。

　　6.使用含puromycin（5μg/mL）的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，對(duì)篩選7天后的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色，并拍照記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

09/其他相關(guān)產(chǎn)品