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Cell Counting Kit-8
Catalog Number：P11110
01/產品概述
LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8 P11110，簡稱CCK-8或CCK8試劑盒，是一種基于WST-8（水溶性四唑鹽，化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）而廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒，是MTT、XTT、MTS等的優良替代方法。
WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan(圖1)。對于相同起始量的細胞，細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同種細胞，顏色的深淺(生成的formazan量)與細胞數目呈線性關系(圖3)。
圖1.WST-8檢測原理圖（EC=electroncouplingreagent，即電子耦合試劑）
WST-8是MTT的一種升級替代產品，和MTT或其它MTT類似產品如XTT、MTS等相比有以下明顯的優點：
(1)MTT被線粒體內的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶液來溶解，而WST-8和XTT、MTS產生的formazan都是水溶性的，可以省去后續的溶解步驟，WST-8產生的formazan比XTT和MTS產生的formazan更易溶解。
(2)WST-8比XTT、MTS更加穩定，使實驗結果更加可靠。
(3)WST-8和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。
LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8 P11110為即用型試劑，使用方法十分便捷，無須再進行任何配制等操作，無須使用同位素，所有的檢測步驟僅在同一塊96孔板內即可完成。不必洗滌細胞，不必收集細胞，也不必采用額外的步驟溶解formazan，可以用于大批量樣品的檢測。同時，WST-8對細胞無明顯毒性，加入CCK-8溶液顯色后，可以在不同時間反復用酶標儀讀板，使檢測時間更加靈活，便于找到最佳測定時間。LeapWalCellCountingKit-8CCK-8可以應用于細胞增殖和細胞生長抑制檢測、毒性測定、藥物篩選、腫瘤藥敏等試驗。
02/產品組分
03/保存條件
冰袋（wetice）運輸。4℃避光保存，有效期12個月。-20℃避光保存，有效期24個月。
04/產品特點
即用型試劑，無須再進行任何試劑的配制
對細胞無明顯毒性，檢測時間更加靈活，可在不同時間點反復/連續讀值
顯色穩定，使實驗結果更加可靠
線性范圍寬，靈敏度高
可用于大批量樣品的檢測
05/實驗流程概要
06/實驗步驟
一.制作標準曲線（使用此標準曲線的前提條件是試驗條件*一致）
1.先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液的細胞數量，然后接種細胞；
2.按比例依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般需要做5-7個細胞濃度梯度，每組4-6個復孔；
3.接種后培養4-6小時使細胞貼壁（懸浮細胞可省略此步驟）；
4.加入LeapWal Cell Counting Kit-8試劑（每100μL培養基加10μLCCK-8）。培養一定時間（0.5-4小時）后測定OD450，制作出一條以細胞數量為橫坐標，OD450為縱坐標的標準曲線，根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量。
二.細胞活性檢測
1.在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔），將培養板放在培養箱中預培養16-24小時；
2.向每孔中加入10μLCCK-8溶液，切勿產生氣泡，氣泡會影響OD值的讀數；
3.將培養板置于培養箱內孵育0.5-4小時；
4.用酶標儀測定450nm處的吸光度。
三.細胞增殖-毒性檢測
1.在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔），將培養板放在培養箱中預培養16-24小時；
2.向培養板加入不同濃度的待測藥物（依據實驗者具體方案而定）；
3.將培養板置于培養箱內孵育一段時間（依據實驗者具體方案而定）；
4.向每孔加入10μLCCK-8溶液，切勿產生氣泡，氣泡會影響OD值的讀數；
5.將培養板置于培養箱內孵育0.5-4小時；
6.用酶標儀測定450nm處的吸光度。
Ø如果待測物質有氧化性或還原性，可在加入CCK-8之前，棄去舊培養基，用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基，來去除藥物的影響。當藥物影響較小時，也可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白對照孔的吸光度值即可。
07/計算公式
細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%
抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%
As:實驗孔吸光度（含細胞、培養基、CCK-8溶液和藥物溶液）
Ac:對照孔吸光度（含細胞、培養基、CCK-8溶液，不含藥物）
Ab:空白孔吸光度（含培養基、CCK-8溶液，不含細胞、藥物）
08/適用范圍
1.細胞增殖測定：CCK-8是水溶性的，在培養基中穩定且無毒。
2.細胞活性和細胞毒性分析：代謝活性以及染料的形成與細胞的活性和損傷成比例。
3.細胞因子分析：測定細胞因子誘導的增殖，必要時，可在試驗結束時回收和擴增細胞。
09/注意事項
1.使用96孔板進行檢測時，需考慮液體蒸發問題。由于96孔板周圍一圈最容易蒸發，建議棄用周圍一圈，改加等量的PBS、水或培養液。
2.細胞增殖實驗建議每孔加入100μL2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100μL5000個細胞（具體每孔所用的細胞數目，需根據細胞大小、細胞增殖速度等因素決定）。按照實驗需要進行培養并給予0-10μL特定的藥物刺激。
3.本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應，還原劑（例如，抗氧化劑）會干擾檢測結果，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。
4.測試藥物如含有金屬，對CCK-8顯色會有影響。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%，15%，90%的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM，將會*抑制，需設法去除。
5.培養基中的酚紅不會影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
6.檢測時，如果起始培養體積為100μL，每孔加入10μLCCK-8溶液。如果起始培養體積為200μL，則需加入20μLCCK-8溶液，其它情況以此類推。可以用加了相應量細胞培養液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。如果擔心所使用的藥物會干擾檢測，需設置加了相應量細胞培養液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。
7.CCK-8的培養時間一般為0.5-4小時，對于大多數情況孵育1小時即可。孵育時間的長短需根據細胞類型和細胞密度等實驗情況而定，需要摸索條件，初次實驗時可以在0.5、1、2和4小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的時間點用于后續實驗。
8.在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于600nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。
9.酶標儀檢測前需確保孔內沒有氣泡，否則會干擾測定結果。
10.需要測定細胞的具體數量時，建議同時做標準曲線。
11.若檢測樣本較多，建議采用多通道移液器，以減小工作量及平行孔間的差異。
12.以下方法可以終止CCK-8反應(96孔板):(a)顯色反應后，將培養板放置于4℃冰箱內。(b)每孔加入10μL0.1MHCl溶液。(c)每孔加入10μL1%(w/v)SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液。注意：反應停止后，應在24小時內測定。
13.為了您的健康安全，請規范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗。
14.本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。
10/實驗案例分析
1.將不同數量的HeLa細胞按照每孔100μL培養液接種于96孔板中，培養24小時后細胞充分貼壁，每孔加入10μLCCK-8溶液。
2.孵育1小時后測定450nm的吸光度值，檢測結果如圖3所示。（檢測結果僅供參考，實測數據會因檢測儀器等的不同而存在差異）
圖3: CCK-8 試劑盒檢測細胞活性
