1.轉(zhuǎn)染前一天鋪HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，以6wellplate為例，細(xì)胞數(shù)目約為0.5x106cells。
2.在無菌管中加入目的DNA質(zhì)粒(1-2ug)及無血清的DMEM或者Opti-MEM。
3.在無菌管中加入無血清的DMEM或者VGF轉(zhuǎn)染試劑4-10ug。
4.將2和3步中的溶液混合，室溫放置20-30min。
5.將4步所得混合液逐滴加入至6wellplate中。
6.轉(zhuǎn)染48h后，吸棄培養(yǎng)基，加入終濃度為1-10ug/mlPLM-Puromycin試劑的培養(yǎng)基2ml。
7.再培養(yǎng)48h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，不含嘌呤霉素的細(xì)胞會(huì)飄起死亡，轉(zhuǎn)入含嘌呤霉素抗性質(zhì)粒的細(xì)胞則貼壁生長(zhǎng)。再次吸棄培養(yǎng)基，加入終濃度為1-10ug/mlPLM-Puromycin試劑的培養(yǎng)基2ml，繼續(xù)殺死無嘌呤霉素抗性的細(xì)胞。
8.再培養(yǎng)48h，若細(xì)胞仍然貼壁生長(zhǎng)且?guī)缀蹰L(zhǎng)滿，結(jié)果說明我們的目的質(zhì)粒含有嘌呤霉素抗性基因，否則目的質(zhì)粒不含嘌呤霉素抗性基因。
注意事項(xiàng)：篩選細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞接種密度不能過大，以免影響篩選效率。當(dāng)細(xì)胞密度比較大時(shí)，可加本試劑反復(fù)篩選，直至對(duì)照細(xì)胞死亡。建議的一般哺乳動(dòng)物細(xì)胞選用的有效濃度范圍為1-10μg/ml,使用前要做濃度篩選，選擇合適的濃度。
